对于生信专业的小伙伴来说，免疫荧光图像定量分析是常见的数据分析之一。免疫荧光分析主要包括荧光强度、阳性面积、共定位分析和细胞计数等。本期教程我们来学习一下使用ImageJ处理细胞免疫荧光数据计算平均荧光强度并进行绘图全过程。其中数值越大，荧光信号越强，目标蛋白表达量就越高（前提是实验条件一致）。

1.打开Image J软件，跳出弹窗，如下图所示；

2.点击File—Import—Image Sequence—选择需要处理多张图片的文件夹，

选择第一张图片，点击打开（注：可批量处理多张图片，注意图片格式和图片标尺为一致）；在跳出的对话框，确认一下图片数量是否正确；

3. 对于16-bit或8-bit的图像，直接进行下一步；如果图像是RGB格式，先分离出单一通道，一次点击Image—Color—Split Channels；这里以RGB格式为例，如下图所示；

4.选择目标通道，这里以Green通道为例，调整阈值，点击Image—Adjust—Threshold；统一调整阈值，这样可以减少带误差。使用红色（Red）来标记选中的区域，勾选“Dark Background”以适应黑色背景的荧光图像。这里需要注意的是，不需要点击Apply和set，红色标记即表示区域已选中；

5. 设定需要测量的参数，依次点击Analyze—Set Measurements，将Area、Standard deviation、Mean gray value、Limit to threshold勾选上；

6.计算图片的平均荧光强度，依次点击Analyze—Measure；

7. 得到的Mean值，即我们所选这张图片的平均荧光强度，但是要注意这个数量计算是相对的；

8. 利用上述方法，分析出全部平均荧光强度，再用每组得出的三个样本图的平均荧光强度，每个值都要除control组的平均值，即归一化的平均荧光强度；

9.打开Graphpad软件，把数据复制进来；

10.点击Analyze，在Column analyses处选择One-way ANOVA，在跳出的对话框选择Multiple Comparisons，选择Compare the mean of each column with the mean of every other column；

11.点击New Graph，选择带数据点的柱状图，点击ok；

12.绘制出来的图形如下图所示：

13.接着对图形进行细节美化，其中包括修改柱状图颜色、字体、标题等，其最终效果图如下图所示：

利用ImageJ计算免疫荧光平均强度，本质上是把主观肉眼看图变成客观可统计的数据，图形和数据可视化更能为我们的论文加分。大家也快去试试吧！

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