一、为什么只看模型介绍还不够

RFdiffusion 系列论文通常会从任务、结果和实验验证角度介绍模型，例如能不能生成 binder、能不能 scaffold motif、能不能设计酶活性位点、能不能扩展到全原子相互作用。这些内容很重要，但如果只停留在模型介绍层面，会有一个问题：我们知道它“能做什么”，但不清楚它“为什么能做”和“具体怎么做”。

对于真正想使用 RFdiffusion 系列模型的人来说，更关键的问题其实是：

模型输入是什么？
扩散过程扩散的到底是什么？
contig 字符串如何控制生成结构？
motif、hotspot、ligand、active site 是如何作为条件进入模型的？
模型输出的 PDB 为什么通常只有骨架？
为什么还需要 ProteinMPNN、LigandMPNN、Chai-1、AlphaFold 或 RF3 做后续筛选？
RFdiffusion2 和 RFdiffusion3 在代码层面与 RFdiffusion1 的差异是什么？

因此，这版报告将 RFdiffusion 系列拆成两条线来讲：

第一条线是模型演进线：从蛋白骨架生成，到全原子建模，再到酶活性位点和统一相互作用设计。
第二条线是算法实现线：从坐标加噪、去噪生成、条件控制、序列设计，到结构预测和筛选。

二、RFdiffusion1 的核心算法原理

1. 它不是直接生成序列，而是先生成蛋白骨架

RFdiffusion1 的核心思想不是“给定目标，直接生成氨基酸序列”，而是先生成一个三维蛋白骨架。这个骨架主要由每个残基的主链坐标和局部刚体框架表示。

可以简单理解为，每个氨基酸残基不是一个孤立点，而是一个带方向的局部坐标系。模型需要生成的不只是 Cα 在哪里，还要知道这个残基的朝向是什么。这样才能描述蛋白主链的空间走向。

RFdiffusion1 的基本流程是：

1. 从真实蛋白结构中取出残基框架；

2. 对坐标和方向逐步加噪；

3. 训练模型学习如何从带噪结构恢复干净结构；

4. 生成时从随机噪声开始，逐步去噪得到蛋白骨架；

5. 再用 ProteinMPNN 根据骨架设计序列；

6. 最后用 AlphaFold2、ESMFold 或其他结构预测工具验证序列是否能折叠回设计骨架。

所以 RFdiffusion1 不是一个完整的“序列到功能”闭环模型，而是一个“结构生成器”。它负责提出骨架假设，ProteinMPNN 负责补序列，结构预测模型负责验证这个假设是否可信。

2. 扩散过程扩散的是什么

在图像扩散模型中，模型对像素加噪，然后学习去噪。在 RFdiffusion 中，模型对蛋白结构加噪。这里的结构包括两类信息：

一类是每个残基的位置，也就是平移信息。
另一类是每个残基的朝向，也就是旋转信息。

因此，RFdiffusion 的扩散空间不是普通二维图像，而是三维几何空间。它需要同时处理平移和旋转。平移可以理解为对 Cα 坐标加高斯噪声；旋转则需要在 SO(3) 空间中进行处理。

简化后可以表示为：

真实结构 X0
    ↓ 加噪
Xt = noising(X0, t)
    ↓ 模型预测
X0_hat = RFdiffusion(Xt, 条件信息, t)
    ↓ 根据 X0_hat 更新
Xt-1 = denoise(Xt, X0_hat)
    ↓ 重复多步
最终得到设计骨架

在每一步中，模型并不是直接预测下一步结构，而是预测最终干净结构 X0 的估计值。然后采样器根据当前带噪结构 Xt 和模型预测的 X0_hat，计算下一步 Xt-1。

这个思想非常重要。它意味着模型每一步都在问：“如果当前这个模糊结构最终要变成一个真实蛋白，那么它应该长成什么样？”

3. self-conditioning 的作用

RFdiffusion1 中一个重要技巧是 self-conditioning。它的意思是：模型在当前去噪步骤中，不只看当前的带噪结构 Xt，还会参考上一步预测出来的 X0_hat。

简化理解为：

第 t 步输入 = 当前带噪结构 Xt + 上一步预测的干净结构 X0_hat(t+1)
第 t 步输出 = 新的干净结构预测 X0_hat(t)

这和 AlphaFold/RoseTTAFold 中的 recycling 思想很像。模型不是每一步都从零开始判断，而是不断根据前一步的判断进行修正。

self-conditioning 的价值在于提高轨迹连续性。没有 self-conditioning 时，模型每一步可能都在独立猜测最终结构，轨迹容易不稳定；加入 self-conditioning 后，模型更像是在不断细化同一个结构假设。

4. 条件生成是如何实现的

RFdiffusion1 的强大之处不只是无条件生成，而是可以在不同约束下生成结构。常见约束包括：

无条件生成：只给定长度，让模型生成一个新蛋白。
motif scaffolding：固定一个功能片段，让模型围绕它补全 scaffold。
binder design：固定目标蛋白，让模型生成结合蛋白。
hotspot conditioning：指定目标蛋白上的关键接触残基。
symmetry conditioning：指定对称性，生成 Cn、Dn 或其他对称结构。
partial diffusion：从已有结构出发，只做局部扰动和改造。

这些条件在代码中通常通过 contigmap.contigs、inference.input_pdb、ppi.hotspot_res、inference.symmetry、diffuser.partial_T 等参数体现。

其中最重要的是 contig 字符串。它是 RFdiffusion 的“设计语言”。

例如：

'contigmap.contigs=[150-150]'

表示生成一个长度固定为 150 aa 的蛋白。

'contigmap.contigs=[5-15/A10-25/30-40]'

表示保留输入 PDB 中 A 链 10–25 位作为 motif，在 motif 前面生成 5–15 个残基，在后面生成 30–40 个残基。

'contigmap.contigs=[B1-100/0 100-100]'

表示保留 B 链 1–100 位作为目标链，同时生成一个 100 aa 的 binder。/0 表示链断开。

5. RFdiffusion1 的运行流程

一个标准 RFdiffusion1 设计流程可以拆成四步：

步骤 1：准备输入结构
    目标蛋白 PDB / motif PDB / 空输入

步骤 2：运行 RFdiffusion
    生成 backbone-only PDB 和 trb 元数据文件

步骤 3：运行 ProteinMPNN
    根据骨架设计多个候选序列

步骤 4：结构预测与筛选
    AlphaFold2 / ESMFold / AF3 / Chai-1
    评估 pLDDT、pAE、RMSD、interface score、motif RMSD 等指标

RFdiffusion1 输出的 PDB 文件通常不应该被理解为最终蛋白结构。因为它主要输出骨架，设计区域经常以 glycine 表示，没有可信侧链。因此，必须接 ProteinMPNN 或类似 inverse folding 模型来补序列。

三、RFdiffusion1 的代码操作示例

1. 环境准备

典型安装流程如下：

git clone https://github.com/RosettaCommons/RFdiffusion.git
cd RFdiffusion

mkdir models
cd models

# 下载模型权重
wget <Base_ckpt.pt>
wget <Complex_base_ckpt.pt>
wget <ActiveSite_ckpt.pt>

cd ..

# 创建环境
conda env create -f env/SE3nv.yml
conda activate SE3nv

cd env/SE3Transformer
pip install --no-cache-dir -r requirements.txt
python setup.py install

cd ../..
pip install -e .

实际部署时，最容易出问题的是 CUDA、PyTorch 和 SE(3)-Transformer 的版本。建议优先使用官方 Docker 或 Colab 版本验证流程，再迁移到服务器。

2. 无条件生成蛋白骨架

./scripts/run_inference.py \
  'contigmap.contigs=[150-150]' \
  inference.output_prefix=outputs/uncond/test \
  inference.num_designs=10

这会生成 10 个长度为 150 aa 的蛋白骨架。

输出通常包括：

outputs/uncond/test_0.pdb
outputs/uncond/test_0.trb
outputs/uncond/traj/

其中：

.pdb 是最终生成骨架；
.trb 保存 contig 映射、输入输出残基编号、配置参数等元信息；
traj/ 保存去噪轨迹，可以用于观察结构如何从噪声逐步形成。

3. motif scaffolding

假设输入 PDB 为 motif.pdb，需要固定 A 链 10–25 位：

./scripts/run_inference.py \
  inference.input_pdb=inputs/motif.pdb \
  'contigmap.contigs=[5-15/A10-25/30-40]' \
  inference.output_prefix=outputs/motif/design \
  inference.num_designs=50

这类任务的筛选重点不是只看整体 RMSD，而是要重点看 motif 是否被准确保持：

motif RMSD < 1 Å
overall backbone RMSD < 2 Å
pAE < 5
pLDDT 较高

4. protein binder design

假设目标蛋白是 B 链 1–100 位：

./scripts/run_inference.py \
  inference.input_pdb=inputs/target.pdb \
  'contigmap.contigs=[B1-100/0 80-120]' \
  'ppi.hotspot_res=[B35,B38,B42]' \
  inference.output_prefix=outputs/binder/design \
  inference.num_designs=100

这里的 ppi.hotspot_res 是设计成败的关键。它告诉模型 binder 应该接触目标蛋白上的哪些位置。如果 hotspot 选得太散，模型可能难以形成稳定界面；如果选得太少，模型可能结合到不理想区域。

5. partial diffusion

如果你已经有一个初始 binder-target 复合物，只想对 binder 做多样化，可以使用 partial diffusion：

./scripts/run_inference.py \
  inference.input_pdb=inputs/complex.pdb \
  'contigmap.contigs=[100-100/0 B1-150]' \
  diffuser.partial_T=20 \
  inference.output_prefix=outputs/partial/design \
  inference.num_designs=50

partial_T 越大，扰动越强，多样性越高，但越可能偏离原始结构。partial_T 越小，结构保守性越强，但探索空间更窄。

6. 环肽或 macrocycle 设计

RFdiffusion 的 RFpeptides 模式可以生成环肽。典型参数是：

./scripts/run_inference.py --config-name base \
  inference.input_pdb=inputs/target.pdb \
  'contigmap.contigs=[12-18 A3-117/0]' \
  inference.cyclic=True \
  inference.cyc_chains='a' \
  ppi.hotspot_res=['A51','A52','A50'] \
  diffuser.T=50 \
  inference.output_prefix=outputs/cyclic/design \
  inference.num_designs=20

这里需要注意，RFdiffusion 生成的是骨架约束意义上的 macrocycle。对于真实化学成环，比如首尾酰胺键、二硫键、非天然连接子，后续仍然需要用 Rosetta、PyRosetta、AF3 或专门的几何筛选脚本进一步验证。

四、RFdiffusion1 后处理代码逻辑

1. 为什么要接 ProteinMPNN

RFdiffusion 输出的是骨架，ProteinMPNN 根据骨架设计序列。一个简单流程是：

python ProteinMPNN/run.py \
  --pdb_path outputs/binder/design_0.pdb \
  --out_folder mpnn_outputs/design_0 \
  --num_seq_per_target 8 \
  --sampling_temp "0.1"

一般建议每个骨架生成多个序列。因为同一个骨架可能有多种可行序列，其中一部分能折叠回设计结构，另一部分不能。

2. 为什么要接 AlphaFold / Chai / RF3

ProteinMPNN 设计出的序列只是“符合骨架几何的序列”，不代表它真实会折叠成该骨架。因此需要结构预测模型做回折验证。

筛选逻辑可以写成：

RFdiffusion backbone
    ↓
ProteinMPNN sequences
    ↓
AlphaFold / Chai / RF3 prediction
    ↓
比较 predicted structure 与 designed backbone
    ↓
保留高可信候选

常见筛选指标包括：

单体设计：
- pLDDT
- pAE
- predicted RMSD to designed backbone
- radius of gyration
- secondary structure 是否合理

binder 设计：
- binder 自身 pLDDT
- interface pAE / iPAE
- target-binder 接触面积
- hotspot 是否被接触
- interface RMSD
- 是否存在 clash
- 是否形成过深或过浅界面

motif scaffolding：
- motif RMSD
- motif 原子几何是否保持
- scaffold 是否遮挡活性位点
- 是否形成合理口袋

一个简单的筛选脚本伪代码如下：

import pandas as pd

df = pd.read_csv("all_design_metrics.csv")

filtered = df[
    (df["plddt"] > 80) &
    (df["pae"] < 5) &
    (df["backbone_rmsd"] < 2.0) &
    (df["motif_rmsd"] < 1.0)
]

filtered = filtered.sort_values(
    by=["motif_rmsd", "backbone_rmsd", "plddt"],
    ascending=[True, True, False]
)

filtered.to_csv("filtered_designs.csv", index=False)

对于 binder，还应该增加界面指标：

filtered = df[
    (df["binder_plddt"] > 80) &
    (df["interface_pae"] < 10) &
    (df["interface_contacts"] > 20) &
    (df["clash_count"] == 0)
]

五、RFdiffusionAA：从骨架生成走向全原子建模

RFdiffusion1 的主要问题在于，它对功能化学的描述不够直接。它能很好地生成骨架，但很多生物功能并不只由骨架决定，而是由侧链原子、小分子、金属离子、核酸和共价修饰共同决定。

RFdiffusionAA 的出现，就是为了让模型能够处理更复杂的全原子生物分子系统。

它的核心变化是表示方式改变了。

RFdiffusion1 主要看 residue frame，也就是残基级别的骨架框架。
RFdiffusionAA 则允许一部分对象被 atomized，也就是以原子级方式表示。
这使得模型可以看到小分子、金属、核酸和非标准残基。

从算法角度看，RFdiffusionAA 的关键不是简单“加了配体”，而是让模型在同一个结构图中同时处理 residue-level token 和 atom-level token。

可以简单理解为：

普通蛋白残基：作为 residue token 处理
小分子原子：作为 atom token 处理
金属离子：作为 atom token 处理
活性位点关键侧链：可以 atomized
核酸或修饰基团：可进入全原子上下文

这为 RFdiffusion2 的酶活性位点设计打下了基础。因为酶设计真正关心的是某些功能原子的位置和方向，而不是只关心残基编号。

六、RFdiffusion2 的算法原理

1. RFdiffusion2 解决的问题

RFdiffusion2 主要针对 enzyme active site scaffolding。它解决的是这样一个问题：

给定一组反应相关的功能原子，例如催化残基的末端原子、底物原子、金属配位原子，能不能让模型自动生成一个蛋白 scaffold，把这些原子放在正确的三维几何关系中？

传统方法通常需要先指定：

第几个残基是 His
第几个残基是 Asp
第几个残基是 Lys
这些残基采用什么 rotamer
它们分别在序列中什么位置

RFdiffusion2 尝试去掉这些人工步骤。它允许输入 unindexed atomic motif，也就是只给定功能原子的空间几何，而不提前指定它们属于最终序列的哪个位置。

这对酶设计非常重要。因为活性位点的关键不是“第 50 位一定是 His”，而是“某个 His 的 N 原子必须在这里，能够与底物形成正确作用”。

2. unindexed motif 是什么

在 RFdiffusion1 中，motif 通常是 indexed 的。也就是说，输入 PDB 中的 A10-25 被固定，输出中也有明确映射。

而在 RFdiffusion2 中，motif 可以是 unindexed 的。模型知道这些功能原子的空间关系，但不知道它们最终应该落在哪些序列位置上。

简化理解：

RFdiffusion1:
固定 A10、A20、A35 这些残基 → 生成 scaffold

RFdiffusion2:
固定某些功能原子的空间位置 → 模型自己决定它们对应哪些残基和序列位置

这使模型可以同时采样三个变量：

scaffold backbone
+ catalytic residue sequence index
+ catalytic side-chain rotamer

这就是 RFdiffusion2 相比 RFdiffusion1 的核心算法提升。

3. flow matching 的意义

RFdiffusion2 不再只是沿用 RFdiffusion1 的经典 DDPM 采样思想，而是引入 flow matching。可以把它理解为：模型学习一条从噪声分布流向真实结构分布的连续向量场。

DDPM 更像是学习一步步去噪；flow matching 更像是学习从噪声到数据的运动方向。对于复杂全原子约束任务，flow matching 可以使训练和采样更稳定。

简化伪代码如下：

# x0: 真实结构
# x1: 噪声结构
# t: 0 到 1 之间的时间
# xt: x0 与 x1 之间插值得到的中间状态

xt = interpolate(x0, x1, t)

# 模型学习在 xt 处应该朝哪个方向移动
v_pred = model(xt, t, condition)

# 目标向量场
v_target = x0 - x1

loss = mse(v_pred, v_target)

在真实模型中，这个过程要处理 SE(3) 几何、原子类型、残基框架、配体、小分子和 motif 约束，不会像上面这么简单。但这个伪代码可以帮助理解 flow matching 的核心思想：模型不是只预测干净结构，而是学习从噪声走向真实结构的流动方向。

4. RFdiffusion2 的 pipeline

RFdiffusion2 的完整流程通常是：

输入：
    ligand / theozyme / active-site motif / unindexed atoms

步骤 1：RFdiffusion2 生成 backbone + atomized motif region

步骤 2：理想化处理
    backbone idealization
    deatomization
    unindexed residues assignment

步骤 3：LigandMPNN 进行序列设计和侧链 packing

步骤 4：Chai-1 或其他结构预测模型 refolding

步骤 5：计算 motif recapitulation metrics
    backbone RMSD
    Cα RMSD
    full-atom RMSD
    motif-atom RMSD

这里最重要的是：RFdiffusion2 的输出不是直接进入实验的最终酶，而是进入一个多步筛选流程。生成结构只是第一层，序列拟合和 refolding 验证同样关键。

七、RFdiffusion2 的代码操作示例

1. 环境和容器

RFdiffusion2 官方代码目前更推荐使用 Apptainer / Singularity 容器运行：

git clone https://github.com/RosettaCommons/RFdiffusion2.git
cd RFdiffusion2

export PYTHONPATH="/path/to/RFdiffusion2"

# 下载模型权重和容器
python setup.py

运行命令通常写成：

apptainer exec --nv \
  rf_diffusion/exec/bakerlab_rf_diffusion_aa.sif \
  <python_script> <args>

2. 运行官方 demo

单个 demo 示例：

apptainer exec --nv \
  rf_diffusion/exec/bakerlab_rf_diffusion_aa.sif \
  rf_diffusion/benchmark/pipeline.py \
  --config-name=open_source_demo \
  sweep.benchmarks=active_site_unindexed_atomic_partial_ligand

运行全部 demo：

apptainer exec --nv \
  rf_diffusion/exec/bakerlab_rf_diffusion_aa.sif \
  rf_diffusion/benchmark/pipeline.py \
  --config-name=open_source_demo

这些 demo 能展示三类能力：

1. 从 atomic motif + small molecule 设计酶
2. 从 unknown sequence positions 的 atomic motif 设计酶
3. 使用 RASA conditioning 设计 small-molecule binder

3. 运行 AME benchmark

RFdiffusion2 论文中的 AME benchmark 可以通过如下命令复现：

apptainer exec --nv \
  rf_diffusion/exec/bakerlab_rf_diffusion_aa.sif \
  rf_diffusion/benchmark/pipeline.py \
  --config-name=enzyme_bench_n41_fixedligand \
  in_proc=True

但是这个流程计算量非常大，因为它涉及：

41 个 active sites
每个 active site 生成 100 个 design
每个 design 生成 8 条序列
再进行 Chai folding

因此，在个人服务器或普通工作站上，不建议一上来直接跑完整 benchmark。更合理的方式是先跑单个 demo，确认输入、输出和评估脚本都能正常运行。

4. RFdiffusion2 输出如何理解

RFdiffusion2 的输出比 RFdiffusion1 更复杂，因为它同时包含 indexed backbone region 和 unindexed atomized region。

后处理大致包括：

1. backbone idealization
2. protein deatomization
3. 将 unindexed residues 分配回 indexed backbone
4. LigandMPNN 设计序列并 packing
5. Chai-1 refolding
6. 计算 motif recapitulation metrics

尤其要关注两个问题：

第一，unindexed motif 是否真的被合理放进了 scaffold 中；
第二，LigandMPNN 重新打包后，关键 rotamer 有没有偏离原来的 theozyme 几何。

这也是为什么 RFdiffusion2 的指标中会出现 motif atom RMSD、full atom RMSD、motif ideality difference 等内容。

八、RFdiffusion3 的算法与代码变化

RFdiffusion3 进一步走向统一全原子生物分子相互作用设计。相比 RFdiffusion1 和 RFdiffusion2，它在使用方式上也发生了变化。

RFdiffusion1 主要通过命令行 Hydra 参数控制，例如：

./scripts/run_inference.py 'contigmap.contigs=[150-150]' ...

RFdiffusion3 则更倾向于用 YAML 或 JSON 文件描述任务，然后用 rfd3 design 运行。

1. RFdiffusion3 的输入组织方式

一个最简单的 RFD3 JSON 输入可以写成：

{
  "example_1": {
    "input": "inputs/target.pdb",
    "contig": "50-80,/0,A1-100",
    "length": "150-180"
  }
}

其中：

input：输入 PDB 或 CIF
contig：定义哪些部分生成，哪些部分保留
length：控制最终结构总长度

运行命令是：

rfd3 design \
  inputs=inputs/rfd3_example.json \
  out_dir=outputs/rfd3_example \
  ckpt_path=/path/to/rfd3_checkpoint.pt

输出通常是：

*.cif.gz
*.json

CIF 文件保存结构，JSON 文件保存对应设计配置和元数据。

2. RFD3 的蛋白 binder 设计示例

YAML 文件可以这样写：

insulinr:
  input: inputs/4zxb_cropped.pdb
  contig: 40-120,/0,E6-155
  length: 190-270
  select_hotspots:
    E64: CD2,CZ
    E88: CG,CZ
    E96: CD1,CZ
  infer_ori_strategy: hotspots
  is_non_loopy: true

这里与 RFdiffusion1 的区别很明显：

RFdiffusion1 的 hotspot 通常是 residue-level。
RFdiffusion3 可以指定 residue + atom-level hotspot。

例如 E64: CD2,CZ 表示希望设计结构靠近 E64 残基的 CD2 和 CZ 原子。这种约束比单纯指定 E64 更精细。

3. RFD3 的小分子 binder 设计示例

{
  "buried": {
    "input": "inputs/IAI.pdb",
    "length": "180-180",
    "ligand": "IAI",
    "select_fixed_atoms": {
      "IAI": ""
    },
    "select_buried": {
      "IAI": "C22,C23,C25,C24,C21,C20,N13,C15,C16,N14"
    }
  }
}

这里有几个关键字段：

ligand：指定小分子
select_fixed_atoms：固定配体原子坐标
select_buried：指定哪些配体原子应该被蛋白包埋
select_exposed：指定哪些配体原子应该暴露于溶剂

这说明 RFdiffusion3 不只是生成一个蛋白包住小分子，而是可以控制小分子哪些部分被埋藏、哪些部分暴露。这对 biosensor、配体结合蛋白和小分子诱导蛋白设计很关键。

4. RFD3 的酶设计示例

{
  "cys_1euv_lig": {
    "input": "inputs/1euv_lig.pdb",
    "ligand": "l:g",
    "unindex": "A514,A531,A574,A579-581",
    "length": "100-200",
    "ori_token": [0, 1, 0],
    "select_fixed_atoms": {
      "A514,A531,A574,A579-581": "TIP"
    }
  }
}

这里的 unindex 是关键。它表示这些残基或原子不需要固定在最终序列中的原始编号位置，但它们的关键几何关系需要保留。

select_fixed_atoms 则决定哪些原子真正作为几何约束进入模型。比如 "TIP" 可以理解为只固定末端功能原子，而不是固定整个残基。

5. RFD3 的关键采样参数

常见参数包括：

rfd3 design \
  inputs=inputs/task.json \
  out_dir=outputs/task \
  diffusion_batch_size=8 \
  n_batches=4 \
  inference_sampler.num_timesteps=200 \
  inference_sampler.step_scale=1.5 \
  inference_sampler.use_classifier_free_guidance=True \
  inference_sampler.cfg_scale=1.5 \
  dump_trajectories=True

参数理解如下：

diffusion_batch_size：每个 batch 生成多少个结构
n_batches：生成多少批
num_timesteps：去噪步数，越大通常越慢
step_scale：影响设计性和多样性
use_classifier_free_guidance：是否使用无分类器引导
cfg_scale：条件引导强度
dump_trajectories：是否保存轨迹

RFD3 的特点是条件控制更细。例如，它可以使用：

select_hotspots
select_buried
select_exposed
select_hbond_donor
select_hbond_acceptor
select_fixed_atoms
unindex
ori_token
infer_ori_strategy
partial_t

这些字段让模型可以从“残基层面的设计”进入“原子层面的设计”。

九、从代码角度比较 RFdiffusion1、RFdiffusion2 和 RFdiffusion3

维度	RFdiffusion1	RFdiffusion2	RFdiffusion3
主要运行方式	scripts/run_inference.py	apptainer exec ... pipeline.py	rfd3 design 或 run_inference.py
输入配置	Hydra 命令行参数	benchmark/config pipeline	YAML / JSON specification
核心控制语言	contigmap.contigs	benchmark config + active site motif	contig + selection fields
生成对象	backbone-level protein	enzyme scaffold + atomized motif	all-atom biomolecular interaction
是否直接处理 ligand	有限	支持	支持更灵活
是否支持 unindexed motif	不作为核心能力	核心能力	核心能力之一
序列设计	ProteinMPNN	LigandMPNN	MPNN / LigandMPNN
结构验证	AF2 / ESMFold	Chai-1	RF3 / Chai / AF3 等
输出格式	PDB + TRB + trajectory	PDB + metrics + pipeline outputs	CIF.GZ + JSON
筛选重点	backbone RMSD、motif RMSD、pAE	motif atom RMSD、full atom RMSD、rotamer 保真	atom-level constraints、interface、ligand burial、hbond、RF3 验证

---

十、一个更实用的 RFdiffusion 系列工作流

如果要把 RFdiffusion 系列用于真实项目，不建议只跑模型输出，而应该构建完整 pipeline。

1. binder design pipeline

输入靶点结构
    ↓
选择结合区域和 hotspot
    ↓
RFdiffusion / RFD3 生成 binder backbone
    ↓
ProteinMPNN 设计序列
    ↓
AF2 / AF3 / Chai / RF3 预测复合物
    ↓
筛选：
    binder pLDDT
    interface pAE
    hotspot contact
    clash
    buried surface area
    shape complementarity
    ddG
    ↓
Rosetta relax / interface analysis
    ↓
实验表达和结合验证

2. enzyme design pipeline

定义反应机制
    ↓
构建 theozyme 或 active-site motif
    ↓
选择 catalytic atoms / ligand / metal
    ↓
RFdiffusion2 或 RFD3 生成 scaffold
    ↓
LigandMPNN 序列设计和 packing
    ↓
Chai / RF3 / AF3 refolding
    ↓
筛选：
    motif atom RMSD
    catalytic geometry
    ligand pose
    pocket accessibility
    side-chain rotamer preservation
    active-site burial
    global fold confidence
    ↓
Rosetta enzyme design / MD / QM/MM
    ↓
体外活性筛选

3. cyclic peptide design pipeline

选择靶点口袋或蛋白表面
    ↓
定义 hotspot / interface residues
    ↓
RFdiffusion cyclic mode 生成环肽骨架
    ↓
ProteinMPNN 或定制序列采样
    ↓
几何筛选：
    首尾距离
    二硫键距离
    backbone strain
    clash
    interface contacts
    ↓
AF3 / Boltz / Chai 复合物预测
    ↓
Rosetta relax
    ↓
结合能、稳定性、可合成性筛选

十一、报告结论

RFdiffusion 系列的核心不是“一个模型越来越大”，而是设计对象和约束粒度不断升级。

RFdiffusion1 解决的是骨架生成问题。它把蛋白质结构设计转化为三维几何空间中的扩散去噪问题，并通过 contig、motif、hotspot 和 symmetry 等条件实现可控生成。

RFdiffusionAA 解决的是模型视野问题。它让模型从只看蛋白残基，扩展到可以看见小分子、金属、核酸和非标准化学组分。

RFdiffusion2 解决的是酶设计中的原子级功能约束问题。它不再要求人工预先指定催化残基编号和 rotamer，而是从 unindexed atomic motif 出发，让模型联合生成 scaffold、序列位置和侧链构象。

RFdiffusion3 解决的是统一全原子相互作用设计问题。它把 ligand、hotspot、burial、hbond、unindex、ori token 等条件统一到 YAML/JSON 输入中，使设计从“蛋白骨架生成”进入“原子级相互作用生成”。

从代码实践角度看，RFdiffusion 系列绝不是“一条命令生成药物”。更真实的理解应该是：

RFdiffusion 系列负责提出结构假设；
MPNN / LigandMPNN 负责补全序列；
AF2 / Chai / RF3 / AF3 负责回折验证；
Rosetta / MD / 几何脚本负责精筛；
实验负责最终回答模型是否真的设计成功。

因此，学习 RFdiffusion 系列时，不应该只看论文中的模型图和性能表，而应该同时掌握三件事：

第一，扩散模型在三维结构空间中到底如何生成蛋白；
第二，输入条件如何通过 contig、hotspot、motif、ligand、unindex 等方式进入模型；
第三，模型输出如何进入后续序列设计、结构预测、能量优化和实验验证流程。

只有把这三件事连起来，RFdiffusion 才不只是一个“会生成结构的模型”，而是一个可以嵌入真实蛋白设计项目的工程化设计工具。