摘要

在药物研发阶段，细胞色素P450（CYP450）酶诱导研究是体外药物代谢与药物相互作用（DDI）评估的重要组成部分。传统原代人肝细胞（PHH）虽广泛应用于CYP诱导评价，但在长期培养稳定性、部分CYP亚型表达维持等方面仍存在局限。本文围绕一种全人源肝细胞三培养体系（TCS, Tri-Culture System），系统介绍其在主要CYP酶诱导研究中的应用表现，包括基础表达水平、原型诱导剂刺激后的诱导能力以及EC₅₀与Emax分析结果。研究结果表明，TCS在维持肝细胞长期功能及CYP诱导能力方面表现稳定，尤其在CYP2C酶诱导研究中具有一定应用潜力，可为药物研发中的体外诱导模型选择提供参考。

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关键词

全人源肝细胞；三培养体系；TCS；原代人肝细胞；PHH；CYP450；CYP酶诱导；CYP2C酶诱导检测；肝细胞诱导评估模型；药物代谢研究

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一、引言

在药物研发阶段，新型化合物对主要细胞色素P450（CYP）酶的体外诱导潜能评估是关键环节，传统方法多采用三明治培养的原代人肝细胞（PHH）。尽管PHH结合监管指南往往能较合理地预测临床诱导风险，但对于新一代的肝细胞模型在CYP诱导评估中的表现，目前仍缺乏充分认知。

本研究评估了一种新型的全人源肝细胞三培养系统（TCS），用于检测主要CYP和核受体的基础表达水平，以及在原型诱导剂处理后CYP的诱导水平。这些结果将为TCS在体外诱导研究中的进一步应用提供基础数据支持，并为探索TCS能否克服PHH存在的相关挑战（如CYP2C酶诱导评估难题）提供重要参考。

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二、材料与方法

1、4周培养期内基因基础表达水平的评估

• 将原代人肝细胞（PHH）和饲养细胞接种到24孔胶原包被板上，构建三培养体系（TCS）；
• 在4周培养期内的特定时间点，向孔中加入Trizol试剂裂解细胞；
• 采用氯仿萃取法分离RNA，使用SuperScript IV VILO试剂盒合成cDNA；
• 使用QuantStudio7实时荧光定量PCR系统上的TaqMan芯片检测法评估基因表达。与第1天的表达量相比，使用ΔΔCt法计算倍数变化。

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2、评估CYP表达对原型诱导剂的反应

1. 将原代人肝细胞（PHH）和饲养细胞接种到96孔胶原包被板上，构建三培养体系（TCS）；

2. 培养至第10天，向孔中加入含不同浓度原型诱导剂（含0.1%二甲基亚砜）的培养基（表1）；

3. 细胞暴露于诱导剂48小时，前24小时后更换新鲜培养基和诱导剂；

4. 48小时后，移除培养基，使用mRNA Catcher PLUS纯化试剂盒收集各孔中的RNA；

5. 采用Super Script IV VILO试剂盒合成cDNA，通过QuantStudio7实时荧光定量PCR系统结合TaqMan探针检测法评估基因表达水平，采用ΔΔCt法计算相对于溶媒对照组的倍数变化；

6. 使用GraphPad Prism软件，通过S型曲线拟合数据来确定Emax和EC₅₀值。

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表1. 针对阳性诱导剂处理后诱导潜能评估的CYP酶列表

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表2. 肝细胞供体（1921756）信息

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三、结果

1、三培养体系（TCS）研究中内参基因的筛选

结果显示，各内参基因的Ct值存在差异（图1）。其中GAPDH在培养期间的Ct值具有良好的一致性，因此被选为理想的内参基因。

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图1. 4周培养期内各内参基因表达水平的评估。每个圆点代表第1、4、7、12、17、23或30天的基因表达水平。

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表3. 各内参基因的Ct值统计数据

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2、4周培养期内TCS中CYP酶和核受体的基础表达水平

如图2所示，在TCS建立后的4-12天内，除CYP1A1和CYP2E1外，其余CYP酶和核受体的表达水平均明显升高。大多数受测基因的表达水平在培养第7-12天达到峰值，因此后续的诱导研究选择在培养第10天启动。

这一结果说明，TCS体系能够在较长培养周期内维持较稳定的肝细胞功能状态，并支持关键代谢酶与核受体的持续表达。

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图2. 在基础培养条件下，于4周培养期内的不同时间点检测TCS中各CYP酶和核受体的基因表达水平。

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3、原型诱导剂暴露48小时后主要CYP酶的诱导潜能

经不同浓度原型诱导剂处理48小时后，TCS中所有主要CYP酶均表现出明显的诱导潜能，包括CYP2C家族各亚型（图3）。

各酶的最大诱导倍数（Eₘₐₓ）和半数效应浓度（EC₅₀）数据见表4。此外，在所有主要CYP酶的测试中，当诱导剂浓度达到最高值时，诱导潜能均呈现下降趋势。

研究结果表明：

• TCS体系能够较好维持主要CYP酶的诱导响应能力；
• CYP2C相关诱导研究表现较好；
• TCS在长期培养模型中仍能维持较高代谢功能；
• 对于药物代谢与DDI研究具有一定参考意义。

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图3. 三培养体系（TCS）经不同浓度的多种原型诱导剂处理48小时后，检测各CYP酶的基因表达水平。表达水平以相对于溶媒对照组的倍数变化表示（n=4），通过将曲线限定在观察到的最高倍数变化值，确定各酶的最大诱导倍数（Eₘₐₓ）和半数效应浓度（EC₅₀）。

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表4. 各CYP酶的最大诱导倍数（Eₘₐₓ）和半数效应浓度（EC₅₀）

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四、研究讨论

传统PHH模型虽然被广泛用于CYP诱导研究，但在长期培养过程中，常会出现：

• 肝细胞功能下降；
• CYP表达水平降低；
• 细胞状态不稳定；
• 供体差异较大等问题。

而全人源TCS体系通过引入辅助饲养细胞与长期培养策略，在一定程度上改善了传统模型存在的问题。

从本研究结果来看：

• 大多数CYP酶表达可维持至培养后期；
• 核受体表达稳定；
• 对原型诱导剂具有明显响应；
• CYP2C家族诱导表现较好。

因此，该体系在：

• 药物代谢研究；
• CYP诱导评价；
• DDI风险预测；
• 长期肝毒性研究；
• 肝脏体外模型研究；

等方向具有一定应用潜力。

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五、结论

1. TCS建立后的4-12天内，除CYP1A1和CYP2E1外，CYP酶和核受体的表达水平明显升高；

2. 大多数受测基因在TCS中的表达水平于第7-12天达到峰值；

3. 主要CYP酶在TCS中均对原型诱导剂具有高度诱导性，包括CYP2C酶；

4. 在主要CYP酶的测试中，当诱导剂浓度达到最高值时，诱导潜能均有所下降。

总体来看，全人源肝细胞三培养体系（TCS）在长期培养稳定性与CYP450酶诱导研究中表现出良好应用潜力，可作为体外药物代谢与诱导评价的重要研究模型之一。

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参考说明

本文基于原代人肝细胞、CYP450酶等公开研究资料、文献、应用文章整理，仅用于科研技术交流与行业信息分享。