摘要：
原代人肝细胞（Primary Human Hepatocytes，PHHs）是药物代谢、药理学及毒理学研究中的核心模型，但传统培养体系难以长期维持其形态与代谢功能。本文基于全人源三培养体系（TCS）的公开研究资料，系统介绍原代人肝细胞长期培养方法、胆小管网络形成、白蛋白与尿素分泌、细胞色素P450（CYP）活性维持以及Ⅰ相与Ⅱ相代谢功能等关键结果，为药物研发、DILI研究及体外肝模型构建提供参考。

关键词：
原代人肝细胞；PHHs；三培养体系；TCS；肝细胞长期培养；肝细胞培养体系；细胞色素P450；CYP3A4；药物代谢；毒理学研究；肝脏模型；胆小管网络；药物筛选；DILI；体外肝模型

一、引言

原代人肝细胞（PHHs）在临床前药理学和毒理学研究中的应用受到一定限制，部分原因是缺乏便捷的合适培养体系。

理想的肝细胞培养体系通常需要满足以下条件：

  • 操作简便
  • 能支持不同供体来源细胞
  • 可长期维持肝细胞结构与功能
  • 适用于药物代谢与毒理学研究
  • 维持细胞极性与CYP活性

传统三明治培养（Sandwich Culture，SC）体系与共培养体系虽然能够部分改善肝细胞状态，但依然存在一定局限性，例如：

  • 肝细胞功能随时间下降
  • CYP酶活性衰减
  • 细胞极性难以长期维持
  • 供体差异较明显

因此，研究人员开发了：

全人源三培养体系（Tri-Culture System，TCS）

用于长期维持原代人肝细胞的形态与代谢功能。

二、什么是全人源三培养体系（TCS）

TCS体系采用：

  • 原代人肝细胞（PHHs）
  • 两种原代人源饲养细胞（FCs）

共同构建培养环境。

与传统使用小鼠或大鼠来源饲养细胞的体系相比：

TCS具有：

  • 全人源体系
  • 更接近人体微环境
  • 更适合药物代谢研究
  • 更适合长期培养

等特点。

研究中：

将两种基质饲养细胞按照1:1比例混合后：

  • 接种于24孔胶原包被板
  • 再加入冻存原代人肝细胞

从而构建完整三培养体系。

三、TCS体系研究中的主要结果

在为期3周至6周的培养过程中：

研究人员重点评估了：

  • 肝细胞形态
  • 白蛋白分泌
  • 尿素分泌
  • 胆小管形成
  • CYP酶活性
  • 药物代谢能力

等指标。

结果显示：

1、PHHs在TCS中可长期维持稳定形态

来自多个成人供体的原代人肝细胞：

在TCS中能够：

  • 长期保持健康形态
  • 形成多细胞簇
  • 稳定培养长达42天

相比传统SC体系：

TCS中肝细胞状态更加稳定。

2、胆小管网络形成稳定

培养初始5天内：

PHHs逐渐形成：

交织胆小管网络

并形成：

  • 紧密连接
  • 缝隙连接

这些结构对于：

  • 肝细胞极性
  • 药物转运
  • 胆汁分泌

具有重要意义。

3、白蛋白与尿素分泌明显提高

研究显示：

与SC体系相比：

TCS中的PHHs：

白蛋白生成水平：

达到：

  • 30–40 μg/天/10⁶细胞

尿素生成水平：

达到：

  • 55–70 μg/天/10⁶细胞

说明：

TCS更有利于维持肝细胞功能。

4、CYP基因表达明显增强

培养第4天：

TCS中的：

  • CYP1A2
  • CYP2B6
  • CYP3A4
  • Alb

等基因表达：

平均高于SC体系约2倍。

说明：

TCS对于：

  • 药物代谢功能
  • 解毒功能
  • CYP酶活性维持

具有明显优势。

5、Ⅰ相与Ⅱ相代谢长期稳定

第5天后：

TCS中：

  • 咪达唑仑1-羟化
  • 葡萄糖醛酸化
  • 硫酸化

等功能：

可稳定维持至少2周。

说明：

TCS不仅维持肝细胞形态：

也能够长期维持：

代谢功能稳定性。

四、当前肝细胞培养体系面临的问题

目前：

肝细胞体外模型依然面临诸多挑战。

1、动物模型存在物种差异

动物模型虽然广泛应用于药理毒理研究：

但：

  • CYP代谢差异
  • 核受体差异
  • 药物反应差异

会影响结果外推。

2、传统SC体系功能下降较快

传统单培养或三明治培养体系中：

PHHs通常会出现：

  • 极性丢失
  • CYP下降
  • 代谢功能减弱

等问题。

3、非人源共培养体系局限明显

许多共培养体系：

使用：

  • 小鼠细胞
  • 大鼠细胞

作为饲养层。

这会带来：

  • 物种干扰
  • 信号差异
  • 代谢偏差

等问题。

而TCS：

采用全人源体系：

因此更适合：

  • 药物开发
  • DILI研究
  • 长期毒性研究
  • ADME研究

等方向。

五、TCS体系搭建流程

实验流程

图1 三培养体系搭建步骤

图1 三培养体系搭建步骤

具体步骤

1、培养基制备

包括：

  • 过夜解冻
  • 添加补充剂
  • 37℃预热

整体耗时约30分钟。

2、饲养细胞接种

包括：

  • 解冻
  • 计数
  • 接种FCs

耗时约60分钟。

3、原代人肝细胞接种

包括：

  • 解冻PHHs
  • 计数
  • 接种

整体约需2–4小时。

4、培养基更换

每日更换培养基。

六、检测方法解析

研究中采用了多种检测方式：

用于评估：

  • 肝细胞功能
  • CYP活性
  • 代谢稳定性

等指标。

七、蛋白表达检测

通过免疫细胞化学法：

检测：

  • ZO-1
  • Connexin-32
  • CK18
  • 白蛋白（Alb）
  • CYP1A2
  • Vimentin（VIM）

等蛋白表达。

同时：

使用CDFDA：

对胆小管进行染色。

胆小管与蛋白标志物表达

图3 TCS中胆小管形成及蛋白标志物表达

图3 三培养体系（TCS）中胆小管形成及蛋白标志物表达

结果显示：

  • ZO-1阳性
  • Connexin-32阳性
  • CK18阳性

说明：

肝细胞维持了较好的：

  • 极性
  • 细胞连接
  • 功能状态

八、白蛋白与尿素检测

通过：

  • ELISA
  • 比色法

分别测定：

  • Alb
  • 尿素

水平。

功能验证结果

图5 TCS中PHHs功能验证

图5 三培养体系（TCS）中原代人肝细胞功能验证

结果显示：

相比SC体系：

TCS中：

  • Alb生成更高
  • 尿素水平更高
  • 功能维持时间更长

九、CYP酶活性检测

研究采用：

  • 奥美拉唑
  • CITCO
  • 利福平

等诱导剂：

检测：

  • CYP1A2
  • CYP2B6
  • CYP3A4

活性。

CYP诱导结果

图6 CYP1A2、CYP2B6及CYP3A4诱导情况

图6 三培养体系（TCS）中CYP1A2、CYP2B6及CYP3A4诱导情况

结果显示：

TCS中：

  • CYP活性长期稳定
  • 多供体间一致性较好
  • 诱导能力明显优于SC体系

十、Ⅰ相与Ⅱ相代谢功能验证

Ⅰ相代谢

采用：

咪达唑仑（Midazolam）

作为探针。

检测：

  • 1’-羟基咪达唑仑（OH-MDZ）

生成量。

Ⅱ相代谢

采用：

7-乙氧基香豆素（7-EC）

检测：

  • 葡萄糖醛酸化
  • 硫酸化

等功能。

结果显示：

TCS中：

Ⅰ相与Ⅱ相代谢功能：

可长期稳定维持。

十一、TCS长期稳定性分析

长期培养结果

图4 TCS长期稳定性

图4 三培养体系（TCS）的长期稳定性

研究中：

PHHs：

在无Matrigel条件下：

仍能够：

  • 长期维持形态
  • 长期维持CYP活性
  • 长期维持Alb与尿素水平

时间可达42天。

十二、PHHs与FCs比例优化

研究还分析了：

PHHs与FCs不同接种比例。

最佳比例分析

图2 PHHs与FCs比例优化

图2 三培养体系（TCS）中适宜PHHs与FCs比例

结果显示：

适宜比例有助于：

  • 维持CYP活性
  • 提高长期稳定性
  • 提高功能维持能力

十三、供体适用性分析

研究中：

多个成人供体PHHs：

均能够在TCS中：

  • 保持健康形态
  • 保持代谢功能
  • 长期维持CYP诱导能力

说明：

TCS具有：

较好的：

供体适用性与重复性。

十四、结论

综合研究结果：

全人源三培养体系（TCS）具有以下特点：

  • 长期维持PHHs形态
  • 长期维持Alb与尿素功能
  • 稳定维持CYP活性
  • 支持Ⅰ相与Ⅱ相代谢
  • 维持胆小管网络结构
  • 适用于多供体来源PHHs

因此：

TCS是一种：

便捷、稳定、可重复的原代人肝细胞长期培养体系

适用于：

  • 药物研发
  • DILI研究
  • ADME研究
  • 药物代谢
  • 肝毒性评估
  • 临床前毒理学

等方向。

参考文献

  1. LeCluyse E.L., Witek R.P., Andersen M.E., Powers M.J., 2012. Organotypic liver culture models: Meeting current challenges in toxicity testing.

  2. Olson H., Betton G., Robinson D., et al., 2000. Concordance of the toxicity of pharmaceuticals in humans and animals.

  3. Khetani S.R., Bhatia S.N., 2008. Microscale culture of human liver cells for drug development.

  4. Ware B.R., Durham M.J., Monckton C.P., Khetani S.R., 2017. A Cell Culture Platform to Maintain Long-Term Phenotype of Primary Human Hepatocytes and Endothelial Cells.

本文基于公开研究资料整理，仅用于科研信息分享。本文关于人肝细胞（PHHs）、肝细胞培养基、长期培养体系及相关药物代谢与毒理学研究解决方案，支持DILI研究、ADME研究及肝脏体外模型构建应用。

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