摘要：
随着siRNA、ASO等寡核苷酸疗法快速发展，传统动物模型在人源特异性、肝脏递送效率及基因敲低预测方面逐渐暴露局限。本文基于CN Bio PhysioMimix肝脏微生理系统（MPS）实验研究，系统介绍器官芯片在GalNAc偶联寡核苷酸递送、原代人肝细胞摄取、基因敲低及重复给药评价中的应用，并解析肝脏MPS在RNA疗法临床前研究中的应用价值。

关键词：
器官芯片、微生理系统、肝脏MPS、PhysioMimix、寡核苷酸疗法、GalNAc偶联、siRNA、ASO、原代人肝细胞、基因敲低、药物递送、微流控器官芯片、肝脏器官芯片

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一、引言：寡核苷酸疗法临床前测试的核心痛点

随着新药物模式进入临床试验，对与人体相关的体外模型的需求日益增加。传统的临床前动物模型通常无法准确预测药物的疗效和毒性，导致后期药物损耗率居高不下。

诸如寡核苷酸疗法等新药物模式具有高度的人体特异性，需要以人体为核心的开发方法。非人物种通常不适合进行测试，而更相关的选择，如非人灵长类动物，不仅成本高昂，而且在伦理上存在挑战。

因此，与人体相关的新方法学，例如器官芯片技术，对于提高临床前测试的预测能力越来越重要。

器官芯片，也称为微生理系统（Microphysiological System, MPS），通过在灌注式3D支架上培养原代人体细胞，以更具生理相关性的方式复制细胞和组织的功能性生物标志物。

在初次人体试验之前，MPS有潜力为评估和设计寡核苷酸疗法提供一种更具生理学意义的研究途径。

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基于寡核苷酸的疗法，即基于RNA的疗法，是干扰特定RNA分子的短序列，包括：

• 反义寡核苷酸（ASO）
• RNA干扰
• 小干扰RNA（siRNA）
• microRNA
• RNA适配体等

对这些疗法的兴趣源于对人类基因组的深入理解，以及相较于传统小分子药物，它们具备更快的药物发现速度。

近年来，随着脂质纳米颗粒（LNP）和GalNAc偶联技术的发展，肝脏靶向递送能力得到了明显提升。

GalNAc通过肝细胞表面的ASGPR受体实现肝脏靶向：

1. GalNAc偶联寡核苷酸与ASGPR结合；
2. 肝细胞发生受体介导内吞；
3. 治疗性寡核苷酸被释放；
4. 最终靶向特定mRNA序列。

该策略能够：

• 提高递送效率
• 降低脱靶效应
• 延长给药周期
• 降低免疫原性

因此，GalNAc偶联疗法在遗传病、代谢疾病及感染性疾病研究中展现出重要潜力。

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由于寡核苷酸通过GalNAc相关内吞作用被肝细胞快速摄取，因此这一策略已广泛用于肝脏疾病靶向疗法设计。

本研究基于CN Bio PhysioMimix肝脏MPS系统，研究：

• GalNAc偶联siRNA
• GalNAc偶联ASO

在原代人肝细胞中的：

• 摄取能力
• 基因敲低效果
• 重复给药表现
• 长周期培养稳定性

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二、研究目的：建立肝脏MPS寡核苷酸递送评价体系

本文介绍CN Bio PhysioMimix肝脏MPS，用于研究寡核苷酸向肝脏的递送及其被原代人肝细胞的摄取。

该肝脏MPS能够生成：

• 功能稳定
• 状态良好
• 长周期培养

的原代人肝细胞微组织，从而支持：

• 基因敲低研究
• 药物递送研究
• 给药策略评价

等实验。

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为满足RNA疗法体外评价需求，本研究使用：

• 带GalNAc偶联的小干扰RNA
• 不带GalNAc的小干扰RNA
• GalNAc偶联反义寡核苷酸
• 非偶联反义寡核苷酸

靶向原代人肝细胞。

研究结果显示：

• 原代人肝细胞能够有效摄取寡核苷酸；
• GalNAc偶联策略可提高基因敲低效率；
• 肝脏MPS可支持重复给药研究；
• 长周期培养下细胞保持良好功能。

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三、实验材料与方法：肝脏MPS寡核苷酸递送与基因敲低评价体系

1、PhysioMimix肝脏MPS系统

实验使用：

• PhysioMimix Core系统
• 多芯片肝脏-12板

该板包含12个培养孔。

每个孔中均包含：

• 胶原蛋白涂层3D支架
• 独立灌流系统

原代人肝细胞以：

0.6 × 10⁶ cells / 支架

密度接种。

支架孔隙与微流控灌注系统结合，使培养基持续流动，从而：

• 提供氧气交换
• 维持营养供应
• 更接近体内肝脏微环境

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2、实验中使用的寡核苷酸

siRNA体系

实验使用：

• GalNAc-siGAPDH-Cy5
• Naked-siGAPDH-Cy5
• GalNAc-siScrambled-FAM

用于研究：

• 摄取能力
• GAPDH基因敲低

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ASO体系

实验使用：

• GalNAc-ALBASO-Cy5
• Naked-ALBASO-Cy5
• GalNAc-非靶向乱序ASO-FAM

用于研究：

• ALB基因敲低
• ASO摄取
• 给药策略影响

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3、实验检测方法

免疫荧光成像

用于观察：

• Cy5/FAM标记寡核苷酸摄取
• 肝细胞分布
• 微组织结构

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qPCR检测

使用：

• RNA提取
• cDNA反转录
• TaqMan qPCR

分析：

• GAPDH表达
• ALB表达

基因表达采用ΔΔCq分析。

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细胞功能检测

使用：

• 白蛋白ELISA
• LDH显色法

分别评价：

• 肝细胞功能
• 细胞损伤情况

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四、实验结果：PhysioMimix系统下寡核苷酸摄取与疗效评估

结果一：使用PhysioMimix生成稳定3D人肝脏微组织

研究中：

• 原代人肝细胞于第0天接种；
• 每2–3天换液；
• 第4天开始给药；
• 观察周期为14天。

研究发现：

• 肝脏微组织结构稳定；
• 肝细胞功能维持良好；
• 可支持长期递送研究。

图1 使用PhysioMimix核心微生理系统生成3D人肝脏微组织。

(A) PhysioMimix系统概览；
(B) 多芯片肝脏-12板结构；
© 微流控灌流循环；
(D) 14天给药时间线；
(E) 原代人肝细胞形成的3D肝脏微组织。

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结果二：GalNAc偶联siRNA可增强GAPDH基因敲低

实验发现：

• GalNAc-siGAPDH组的GAPDH敲低效果更明显；
• Naked-siRNA虽然可被摄取；
• 但功能性基因沉默能力弱于GalNAc偶联组。

研究同时发现：

尽管Naked-siRNA荧光信号更强，但并不意味着其功能性递送更优。

说明：

“摄取量”与“有效基因沉默”并不完全一致。

这可能与：

• 内吞途径
• 亚细胞定位
• 内涵体逃逸效率

等因素有关。

图2 在肝脏MPS中引入GalNAc偶联、荧光标记的小干扰RNA。

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结果三：GalNAc-siRNA对GAPDH表现出剂量依赖性敲低

研究进一步测试：

• 10 nM
• 50 nM
• 100 nM

不同浓度siRNA。

结果显示：

• GAPDH敲低呈剂量依赖性；
• 浓度越高，敲低效果越明显；
• 同时Cy5摄取信号增强。

此外：

• 白蛋白水平稳定；
• LDH维持低水平；

说明：

不同浓度下未观察明显毒性。

图3 GalNAc偶联靶向小干扰RNA对GAPDH的剂量依赖性敲低。

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结果四：ASO在肝脏MPS中实现持续摄取与ALB敲低

研究在第4天进行单次给药。

结果显示：

• ASO在第14天仍可检测到摄取信号；
• GalNAc-ALBASO对ALB基因敲低效果更明显；
• 肝细胞功能维持稳定。

与siRNA实验结果一致：

GalNAc偶联体系在功能性基因沉默方面更具优势。

图4 单次给药下反义寡核苷酸的持续摄取和有效基因靶向。

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结果五：重复给药进一步增强基因敲低效果

研究比较：

• 单次给药
• 重复给药（第4、6、8天）

结果显示：

重复给药组：

• 摄取量增加；
• 基因敲低更明显；
• 肝细胞功能稳定；
• 未观察明显毒性。

说明：

肝脏MPS非常适合：

• 长周期递送研究
• 多次给药研究
• RNA疗法评价

图5 在肝脏MPS中比较GalNAc偶联反义寡核苷酸的单次和重复给药。

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五、讨论分析：肝脏MPS在RNA疗法中的应用价值

本研究证明：

PhysioMimix肝脏MPS可有效用于：

• siRNA研究
• ASO研究
• GalNAc递送研究
• 原代人肝细胞研究
• 基因敲低研究

相比传统2D培养：

肝脏MPS具备：

• 更真实的人源微环境
• 动态灌流
• 长周期培养
• 重复给药支持
• 更接近体内递送行为

等优势。

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此外，研究还提示：

GalNAc偶联并不一定提高“总摄取量”，但能明显提高：

• 功能性递送效率
• 基因沉默能力

这一结果对于：

• RNA药物设计
• 递送系统优化
• 肝脏靶向开发

具有重要意义。

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六、未来方向：器官芯片在RNA疗法中的潜力

未来肝脏MPS仍可进一步扩展：

1、引入Kupffer细胞

用于研究：

• 免疫毒性
• 炎症反应
• 巨噬细胞参与机制

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2、多器官联动

例如：

• 肝-肾芯片
• 肝-肠芯片

用于研究：

• 药物代谢
• 排泄
• 分布

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3、新型递送体系

包括：

• LNP脂质纳米颗粒
• 双特异性递送
• 新型RNA载体

等。

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七、结论

本研究证明：

基于PhysioMimix的肝脏MPS系统能够：

• 稳定培养原代人肝细胞；
• 有效研究siRNA与ASO递送；
• 支持重复给药；
• 实现功能性基因敲低评价。

研究结果显示：

• GalNAc偶联可明显增强基因沉默；
• 肝脏MPS适用于RNA疗法临床前研究；
• 微生理系统可作为动物模型的重要补充。

对于：

• siRNA
• ASO
• RNA疗法
• 肝靶向递送
• GalNAc偶联研究

而言，器官芯片与微生理系统正在成为重要的发展方向。

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文献参考

1. J. Debacker et al., Mol Ther. 2020
2. K.J. Livak & T.D. Schmittgen, Methods. 2001
3. J. Majer et al., Lab Chip. 2024
4. T.C. Roberts et al., Nat Rev Drug Discov. 2020
5. Rubiano et al., Clin Transl Sci. 2021

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本文基于CN Bio公开研究资料由其中国提供商上海曼博生物整理，用于科研信息分享和相关实验应用参考。