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近日，国际著名期刊《Journal for ImmunoTherapy of Cancer》(IF=10.6/Q1)发表题为“Integrative multiomic profiling of cfDNA methylation and EV-miRNAs identifies immunotherapy-outcome molecular subtypes in NSCLC”的前瞻性纵向队列研究成果，通过基于液体活检的多组学整合分析，为非小细胞肺癌（NSCLC）免疫治疗（IT）患者寻找更精准的预后和预测生物标志物。

研究团队纳入79例接受免疫检查点抑制剂（ICI）治疗的转移性NSCLC患者，在治疗前基线（T1）、第二周期后（T2）、6个月（T3）和1年（T4）四个时间点采集血浆样本，创新性利用cfDNA EM-seq技术对血浆游离DNA（cfDNA）进行甲基化（cfMeth）分析和细胞外囊泡（EV）相关microRNA（EV-miRNA）测序分析。通过多组学因子分析（MOFA2）无监督整合方法，研究在T1和T2两个关键时间点分别鉴定出三种具有显著差异生存结局的分子亚型（MOFA-Derived Clusters, MDCs）。这些亚型不仅在生物学上具有一致性（如与血管生成、免疫信号通路相关），而且其预后价值在独立的外部队列中得到验证，证实MDC分类的临床相关性和时间稳定性，为NSCLC免疫治疗精准分层提供基于液体活检的多组学解决方案。

DOI:10.1136/jitc-2025-013592

标题：cfDNA甲基化和EV-miRNAs的综合多组学分析确定NSCLC中与免疫治疗结果相关的分子亚型

发表时间：2026-1-16

发表期刊：J Immunother Cancer

影响因子：IF10.6/Q1

技术平台：全基因组cfDNA甲基化测序（EM-seq）、miRNA-seq

研究方法

（1）队列与样本

前瞻性纳入79名接受ICIs（单药或联合化疗）治疗的晚期NSCLC患者。在四个时间点（T1治疗前基线、T2第二周期后、T3 6个月、T4 1年）采集外周血。定义原发性耐药（6个月内进展）和非耐药患者。

（2）多组学综合分析

cfDNA EM-seq甲基化分析：同时检测5mC和5hmC两种修饰。定制靶向捕获panel包含344个基因（含2,276个启动子区域）和841个增强子，测序深度500X，测序后进行差异甲基化区域（DMR）分析。

EV-miRNA分析：从血浆中分离EVs，提取总RNA后测序和差异表达分析。

多组学整合：MOFA2无监督整合。首先，筛选与总生存期（OS）或无进展生存期（PFS）显著相关的分子特征。然后，分别对T1和T2时间点数据构建独立MOFA2模型，提取潜在因子。最后，对潜在因子进行聚类，得到MOFA衍生簇（MDCs）。

（3）外部验证

分别对两个组学进行独立验证，通过监督学习模型将MDC标记比对至外部验证队列样本，并进行生存分析。

关键结果

（1）临床特征与多组学模型构建

研究队列包含79名患者，其中55名腺癌，24名非腺癌。在T1（基线）和T2（第二周期后）时间点，分别有71和65份血浆样本用于分析。通过单变量Cox回归筛选，T1模型纳入136个miRNAs和298个cfMeth特征，T2模型纳入81个miRNAs和714个cfMeth特征。MOFA2模型构建后，T1模型解释了miRNA数据23%的变异和cfMeth数据25%的变异；T2模型解释了miRNA数据25%和cfMeth数据50%的变异。表明cfDNA甲基化（cfMeth）在T2时间点（治疗早期）的变异解释度更高，提示治疗可能诱导了更显著的表观遗传重塑。

图1：T1和T2模型的多组学整合与潜在因子构成

（2）MOFA2鉴定出三种具有不同临床结局的潜在分子亚型

基于MOFA2潜在因子的PAM聚类在两个时间点均鉴定出三个分子亚型（MDC1、MDC2、MDC3）。T1模型中（图2），MDC1-T1（n=24）表现为F1和F3高评分，MDC3-T1（n=14）与F2呈强负相关，MDC2-T1（n=33）为中间型。网络分析揭示9个核心EV-miRNA构成调控模块，其中hsa-miR-23b、hsa-miR-200c-3p、hsa-miR-200b-5p和hsa-miR-200a在所有因子中呈正加载，而hsa-miR-451a则表现相反模式。

T2模型中（图3），MDC1-T2（n=21）F2低/F4中等，MDC2-T2（n=20）F4高，MDC3-T2（n=22）F1和F4降低。网络分析鉴定出四个关键miRNA（hsa-miR-6873-3p、hsa-miR-539-5p、hsa-miR-615-3p、hsa-miR-1185-2-3p）。

生存分析显示（图4），T1模型三组间OS和PFS差异显著：MDC1-T1预后最差（中位PFS 4.54个月，OS 7.64个月），MDC2-T1预后居中（PFS 12.23个月，OS 19.71个月），MDC3-T1预后最好（PFS 28.89个月，OS 40.79个月）。T2模型呈现二元风险分层：MDC1-T2和MDC2-T2组成低生存组（中位PFS 4.66/7.71个月，OS 7.78/9.9个月），MDC3-T2为高生存组（PFS和OS均为28.89/40.79个月）。

这些亚型由不同的潜在因子驱动，例如T1模型中，hsa-miR-200c-3p和IQCE、DEDD2等基因的甲基化区域是关键驱动因子。cfDNA EM-seq技术精准捕获这些与预后相关的差异甲基化区域，为区分不同亚型提供关键的表观遗传学证据。

图2：T1 MOFA2模型的综合潜在结构和多组学表征

图3：T2 MOFA2模型的综合潜在结构与多组学表征

图4：基于基线（T1）和早期治疗（T2）时MOFA2衍生的分子亚型（MDCs）生存分析

（3）MOFA衍生簇在T1-T4样本中的纵向比对

为评估MDC的时间稳定性，研究将T1和T2模型的分子特征比对到其他时间点的样本上（图5）。结果发现，T2模型（MDC-T2）的比对表现更稳健。将MDC-T2标签比对到T1、T3样本后，仍能显著区分患者的OS和PFS（图5D），而T1模型的效果较弱。这些结果表明，治疗早期（T2）建立的分子特征比基线特征更能反映治疗适应状态，具有更优的跨时间预后一致性，提示cfDNA甲基化和EV-miRNA在治疗早期的动态变化蕴含了关键的疗效预测信息。

图5：MDC的纵向比对将OS中的NSCLC患者分层

（4）MDC-T1和MDC-T2亚型的多组学分子表征

差异分析揭示各亚型的分子特征。在T1模型中，预后最差的MDC1-T1以miRNA驱动的血管生成、组织重塑和细胞骨架动态通路激活为特征，而cfMeth数据贡献较少。预后最好的MDC3-T1则表现为miRNA和cfMeth层面的低通路激活，但高表达hsa-miR-451a和hsa-miR-4732-5p等有利miRNA。

在T2模型中，预后最好的MDC3-T2显示出强烈的免疫相关和组织重塑通路激活。cfDNA EM-seq技术还发现，BLK和ADARB2基因的甲基化区域在预后好的亚型（MDC3-T1和MDC3-T2）中高甲基化，而在预后差的亚型中低甲基化（图6B），提示这些基因的表观遗传沉默可能与更好的免疫治疗结局相关。

图6：MDC亚型在单一组学分析的关键分子特征及GO功能分析。

1. 在T1和T2时间点单一组学差异表达分析和MOFA2整合模型中，五种最一致富集的EV-miRNA表达谱。
2. 两个持续差异甲基化区域（注释为BLK和ADARB2）在各MDC亚型中的甲基化水平。
3. MDC-T1和MDC-T2中差异表达miRNA和差异甲基化区域的GO通路功能富集热图。

（5）MDC亚型的流式细胞术免疫表型与临床特征

流式细胞术分析（图7）揭示MDC各亚型的系统性免疫表型差异。在T1模型中，预后最好的MDC3-T1表现出更高的细胞毒性CD8+ T细胞丰度和更低的调节性T细胞（Tregs）比例（图7A），提示其具有更有效的抗肿瘤免疫环境。在T2模型中，预后好的MDC3-T2的CD4+ T细胞频率更高，而预后差的MDC1-T2则表现出更高的耗竭性CD8+PD-1+ T细胞比例（图7B）。这些免疫表型与分子亚型的预后分层高度一致，进一步验证MDC的生物学和临床相关性。

图7：流式细胞术分析MDC亚型中的免疫表型

（6）外部验证证实MDC亚型的临床相关性

在独立的外部队列中，MDC的预后价值得到了验证。在SMC队列（肿瘤组织甲基化数据）中，MDC-T2模型可以显著区分患者的PFS（p=0.026），MDC3-T2预后最好（图8A）。在Genova队列（EV-miRNA数据）中，MDC-T2模型同样显著区分患者的OS和PFS，MDC3-T2再次被证实为预后最佳组（图8C）。尽管验证存在样本类型（组织vs血浆）和技术平台（芯片vs测序）的差异，但MDC-T2的稳健性得到了充分证明，揭示了其潜在的临床转化价值。

图8：MDCs在独立cfMeth和miRNA队列中的外部验证。

1. 基于SMC数据集MDC-T1和MDC-T2亚型预测的PFS Kaplan-Meier曲线（肿瘤组织甲基化，n=57）。
2. 基于Genova等队列中MDC-T1亚型预测的OS和PFS分层（EV-miRNA，n=54）。
3. 基于Genova等队列中MDC-T2亚型预测的OS和PFS分层，Kaplan-Meier曲线展示生存分布。

结论和启示

本研究证明，整合cfDNA甲基化（EM-seq）和EV-miRNA的液体活检多组学分析能够有效捕捉NSCLC免疫治疗患者的分子异质性，鉴定出差异生存结局和免疫表型的MDC亚型。这些亚型参与血管生成、免疫调控和细胞骨架重塑等生物学过程，并在纵向样本和外部队列中得到验证。多组学整合框架提供了比单一组学更精细的分层，揭示了肿瘤-免疫动态互作的新见解。

参考文献：Onieva JL, Pérez-Ruiz E, Figueroa-Ortiz LC, Jurado JM, Martínez B, Carlos Benítez J, Rueda-Domínguez A, Barragán I. Integrative multiomic profiling of cfDNA methylation and EV-miRNAs identifies immunotherapy-outcome molecular subtypes in NSCLC. J Immunother Cancer. 2026 Jan 16;14(1) doi: 10.1136/jitc-2025-013592.