介绍

AUGUSTUS 是一款用于在一个或多个基因组中识别基因及其结构的程序。

https://github.com/Gaius-Augustus/Augustus   #官网

安装

Windows

Windows 用户可借助 Windows 子系统 Linux（WSL）安装 AUGUSTUS，安装步骤与下述 Linux 系统的安装方法完全一致。AUGUSTUS 对应的 WSL 配置方法详见此链接。

Ubuntu 18.04、Debian 9 及更高版本

在 Ubuntu 21.04 和 Debian 11 版本之前，仅提供单基因组版本；自该版本起，新增比较基因预测功能。

sudo apt install augustus augustus-data augustus-doc

Docker

通过以下命令基于 Dockerfile 创建 docker 镜像：

git clone https://github.com/Gaius-Augustus/Augustus.git
cd Augustus
docker build -t augustus .

Singularity

通过以下命令基于 Singularity 定义文件创建 Singularity 镜像文件：

git clone https://github.com/Gaius-Augustus/Augustus.git
cd Augustus
singularity build augustus.sif Singularity.def

从源码编译 AUGUSTUS

详细步骤见 INSTALL.md 文件。

从 github 下载源码并编译：

git clone https://github.com/Gaius-Augustus/Augustus.git
cd Augustus
make augustus

编译完成后，bin/augustus 命令应可执行，并会打印使用说明信息。

如需编译辅助工具，请执行：

make auxprogs

本地安装

普通用户可将可执行文件所在目录添加至 PATH 环境变量，示例如下：

export PATH=~/augustus/bin:~/augustus/scripts:$PATH

全局安装

若拥有 root 权限，可将 AUGUSTUS 安装至系统全局路径，示例如下：

sudo make install

此外，你也可执行顶层 Makefile 中 “install” 章节的类似命令，自定义全局安装路径。

可选步骤：设置环境变量 AUGUSTUS_CONFIG_PATH

若设置了环境变量 AUGUSTUS_CONFIG_PATH，augustus 和 etraining 程序会在此路径下查找包含配置文件与参数文件的 config 目录（例如 ~/augustus/config）。你可将以下语句添加至启动脚本（如～/.bashrc）中：

export AUGUSTUS_CONFIG_PATH=/my_path_to_AUGUSTUS/augustus/config/

若未设置该环境变量，程序会在可执行文件所在目录的上级目录中查找 ../config 路径。第三种方式是运行 augustus 时，通过命令行指定该目录：

--AUGUSTUS_CONFIG_PATH=/my_path_to_AUGUSTUS/augustus/config/

WEB-SERVER

你也可通过网页界面运行 AUGUSTUS，地址为：http://bioinf.uni-greifswald.de/augustus/；亦可通过网页服务运行，地址为：http://bioinf.uni-greifswald.de/webaugustus/。

网页版yyds！

直接注释

若存在已经被训练的物种（augustus --species=help查看），则直接使用代码进行预测基因，以拟南芥（arabidopsis）为例：

augustus --speices=arabidopsis test.fa > test.gff

训练注释

若不存在被训练过的物种，则需要进行训练

准备训练集与测试集

根据Augutus的官方教程，应当按如下标准进行基因结构序列准备：

1. 提供gene的编码部分，包括上游的部分（kb级别）。通常情况下，基因越多（>200），则效果越好，与此同时，外显子的数量也要足够，以便后续训练内含子；

2. 必须保证基因的起始密码子与终止密码子是准确的，并尽量提供较为完整的gene结构和注释信息；

3. 防止gene的冗余，根据Augustus教程的建议，如果任意两个gene在氨基酸水平上的相似度高于70%，那么只需保留一条。这一步既可以避免过度拟合现象，也能用于检验预测的准确性；

4. 多个gene可以在一条序列中，gene可以在正链，亦可在负链，但gene之间不可存在重叠；

5. 每个gene只需要一条转录本，并且以GenBank格式存放

这些注释数据需要随机分为训练集和测试集，为了保证测试集有统计学意义，测试集要足够多的基因（100~200个），并且要足够的随机。

基因结构集的可能来源有:

1. Genbank

2. EST/mRNA-seq的可变剪切联配, 如PASA

3. 临近物种蛋白的可变剪切联配，如GeneWise

4. 相关物种的数据

5. 预测基因的迭代训练

数据集的训练

# 格式转换；基于选取物种的GFF3以及ref.fa 文件将其转换为Genbank格式
perl ~/miniconda2/bin/gff2gbSmallDNA.pl ./Spinach_genome/spinach_gene_v1.gff3 ./Spinach_genome/spinach_genome_v1.fa 1000 genes.raw.gb

# 尝试训练，捕捉错误
etraining --species=generic --stopCodonExcludedFromCDS=false genes.raw.gb 2> train.err

# 过滤掉可能错误的基因结构
cat train.err | perl -pe 's/.*in sequence (\S+): .*/$1/' >badgenes.lst
filterGenes.pl badgenes.lst genes.raw.gb > genes.gb

# 提取上一步过滤后的genes.db中的蛋白
grep '/gene' genes.gb |sort |uniq  |sed 's/\/gene=//g' |sed 's/\"//g' |awk '{print $1}' >geneSet.lst
python extract_pep.py geneSet.lst Spinach_genome/spinach_pep_v1.fa

# 将得到的蛋白序列进行建库，自身blastp比对。根据比对结果，如果基因间identity >= 70%，则只保留其中之一，再次得到一个过滤后的gff文件，gene_filter.gff3
makeblastdb -in geneSet.lst.fa -dbtype prot -parse_seqids -out geneSet.lst.fa
blastp -db geneSet.lst.fa -query geneSet.lst.fa -out geneSet.lst.fa.blastp -evalue 1e-5 -outfmt 6 -num_threads 8
python delete_high_identity_gene.py geneSet.lst.fa.blastp Spinach_genome/spinach_gene_v1.gff3

# 将得到的gene_filter.gff3 转换为genbank 格式文件
perl ~/miniconda2/bin/gff2gbSmallDNA.pl  gene_filter.gff3  ./Spinach_genome/spinach_genome_v1.fa 1000 genes.gb.filter

# 将上一步过滤后的文件随机分成两份，测试集和训练集。其中训练集的数目根据gb的LOCUS数目决定，至少要有200（100 为测试集的基因数目，其余为训练集）
randomSplit.pl genes.gb.filter 100

# 初始化HMM参数设置（在相应～/minicode/config/species/relative name中形成参数,若之前已经存在该物种名字，则需要删除），并进行训练
new_species.pl --species=spinach
etraining --species=spinach genes.gb.filter.train

# 用测试数据集检验预测效果，这里可以比较我们训练的结果，和近缘已训练物种的训练效果
augustus --species=spinach genes.gb.filter.test | tee firsttest.out
augustus --species=arabidopsis genes.gb.filter.test | tee firsttest_ara.out

训练结果的检查

在 firsttest.out 的尾部可以查看预测结果的统计，首先需要解释几个统计学概念

1. TP(True Positive): 预测为真，事实为真

2. FP(False Positive): 预测为真，事实为假

3. FN(False Negative): 预测为假，事实为真

4. TN(True Negative): 预测为假，事实为假

基于上述，引出下面两个概念：

1. "sensitivity"等于TP/(TP+FP)（预测到的百分率）， 是预测为真且实际为真的占你所有认为是真的比例；

2. "specificity"等于TN/(TN+FN)（其中正确的百分率）, 是预测为假且实际为假的占你所有认为是假的比例。我们希望在预测中，尽可能地不要发生误判，也就是没有基因的地方不要找出基因，有基因的地方不要漏掉基因。

重训练以优化结果

# 很有可能的一种情况是，我们第一次的训练结果没有已有训练的效果好，所以我们需要进行循环训练找到最优参数；（运行会非常费时间，而且最终的效果一般只能提高准确度几个百分点，慎重使用）
optimize_augustus.pl --species=spinach genes.gb.filter.train

# 再次进行训练，并检验，进行前后比较
etraining --species=spinach genes.gb.filter.train
augustus --species=spinach genes.gb.filter.test | tee secondtest.out

# 如果此时你的gene level的sensitivity还是低于20%说明Trainning set不够大，请添加数据；
# 如果你获得了满意的Trainning结果，请开始prediction吧

氨基酸序列的提取

# 从 firsttest.out 中提取氨基酸序列
sed -n '/^#/p' firsttest.out | sed -n '/start/,/\]/p' | sed 's/# start gene />/g;s/protein sequence \= \[//g;s/#//g;s/\]//g;s/^\s//g' >seq.fa

引用

Mario Stanke, Mark Diekhans, Robert Baertsch, David Haussler (2008). Using native and syntenically mapped cDNA alignments to improve de novo gene finding. Bioinformatics, 24(5), pages 637–644, doi: 10.1093/bioinformatics/btn013

更多参考文献见 docs/REFERENCES.md 文件。

3 个包含命令行实操指南的书籍章节

总结

1. AUGUSTUS 支持多系统安装：Windows（依赖 WSL）、Ubuntu/Debian（apt 安装）、Docker/Singularity（容器化）、源码编译（最灵活）；
2. 安装后需注意配置 PATH 环境变量，可选设置 AUGUSTUS_CONFIG_PATH 指向配置目录；
3. 除本地运行外，还可通过官方网页界面 / 服务使用，相关文献与实操指南可参考指定路径。